Знакомство с особенностями ПЦР анализа

ПЦР (Полимеразная цепная реакция) – относительно простой и недорогой способ, который фокусируется на сегменте ДНК и копирует его миллиарды раз. ПЦР используется ежедневно для диагностики заболеваний, идентификации бактерий и вирусов, криминалистике и т.д.

Как происходит ПЦР реакция?

Праймеры – короткие отрезки ДНК которые создаются в лаборатории. С момента создания, праймеры могут иметь произвольную последовательность нуклеотидов. В ПЦР экспериментах 2 праймера разработаны для соответствия тому сегменту ДНК, который вы хотите скопировать. Во время присоединения праймеров, один из них присоединяется к верхней части сегмента ДНК, а другой праймер к нижней. В большинстве случаев, 2 праймера длиной около 20 нуклеотидов нацелены на одну область во всем геноме. Праймеры также необходимы, потому что ДНК полимеразы не могут просто присоединиться к любому месту и начать процесс копирования. Они могут присоединиться только к существующему участку ДНК.

ДНК полимераза представляет собой натурально полученный комплекс протеинов, функцией которых является копирование ячеек ДНК до того, как оно разделится на две части. Когда молекула ДНК полимеразы сталкивается с праймером, который в свою очередь соединен с более длинным сегментом ДНК, она присоединяет себя ближе к окончанию праймера и начинает добавлять нуклеотиды. (В природе эти праймеры, созданные при помощи энзимы, называются праймезой).

ДНК полимераза в теле человека разрушается при температуре меньше 95°C (203 °F), такая температура нужна чтобы рассоединить две нити ДНК в микропробирке. ДНК полимераза, которая наиболее часто используется в ПЦР диагностике происходит из нитей бактерии, которая называется Thermus aquaticus. Она выживает при температуре кипения и прекрасно работает при 72 °C (162 °F).

Нуклеотиды – это строительные блоки из которых сделана ДНК. Вы добавляете микс четырех типов нуклеотидов в вашу ПЦР реакцию – А, C, G, T. ДНК полимеразы забирают нуклеотиды которые плавают в жидкости и присоединяют их к окончанию праймера.

Что необходимо для оптимальных результатов ПЦР?

Изменение любой составляющей ПЦР реакции может повлиять на качество диагностики, причем как улучшить, так и ухудшить эффективность, качество, специфику реакции и ее чувствительность. Параметры, которые влияют на конечный результат могут быть физическими (температура, время цикла) или химическими (концентрация исходного материала, тип используемых ферментов). Следующие факторы являются ключевыми для успешной ПЦР.

1. Чистота лабораторных условий.

Поскольку ПЦР может обнаружить молекулу ДНК, очень важно поддерживать чистоту лаборатории. Важно всегда одевать чистые перчатки, использовать стерильные стеклянные изделия, микропробирки и наконечники, а также поддерживать стерильность и чистоту рабочего места перед началом работы лаборатории. Необходимо проводить полный контроль реакций, без материала ДНК и ферментов, убедиться в оптимальности результатов амплификации образца ДНК. Большинство людей, для уменьшения вероятности ложноположительных и ложноотрицательных результатов, используют свой собственный комплекс мер и специально разработанные пипетки, которые используются только в ПЦР. Специальные микропробирки для ПЦР, наконечники и работа в вытяжном шкафу с ультрафиолетовым светом также имеют огромное влияние на минимизацию проблем.

2. Лабораторные расходные материалы.

Расходные материалы из пластика имеют огромное влияние на точность результатов ПЦР, экономию реагентов и удобство работы лаборанта. Необходимо чтобы пластик был как можно тоньше, был более гибким, а также важна сама форма изделия. Допустим, если наконечник будет изготовлен некачественно, то он может слететь с носика дозатора и это обернется потерей уникальной ДНК, реагентов, а также возможным попаданием этой ДНК в другие пробы. Весь пластик обязательно должен быть апирогенным, а также очищенным от ДНК и РНК.

3. Химические компоненты.

Также критическое значение имеют чистота и интегрируемость ДНК материала и разработка праймера. Существуют несколько специализируемых программ для разработки праймеров. Лучшие праймеры имеют длину в 18-24 баз, без вторичных структур, сбалансированное распределение пар G/C и A/T, также концы праймеров не должны совпадать друг с другом и температура плавления должна быть на 5-10 °C ниже температуры отжига, которая обычно находится между 55 и 65 °C. Температура плавления обоих праймеров должна быть идентична для достижения наилучшего результата.

4. Состав реакции: материалы и праймеры.

Пропорции реакционной микстуры имеет огромное влияние на качество результатов ПЦР диагностики. Существует общая формула концентрации материалов, ферментов, праймеров и нуклеотидов, но она также может немного изменяться. Оптимальная концентрация праймеров находиться между 0.1 и 0.6 микромолей/л. Количество образца варьируется в зависимости от типа ДНК (человека, бактерии). Для улучшения результатов при использовании небольшого количества образца применяют немного другие стратегии, например увеличенное число циклов или использование «горячего старта». Обязательно нужно протестировать новые праймеры, чтобы убедиться, что они успешно работают под вашими специфическими настройками.

5. Состав реакции: активные ферменты.

Выбор полимеразы ДНК влияет на точность реакции и качество продукта. Традиционная Taq полимераза во многих лабораториях была заменена на более точные ферменты (при использовании которых меньше ошибка). Концентрация MgCl2 в реакционном миксе может влиять на результаты ПЦР и может играть важную роль в более капризных реакциях. Катионы магния формируют растворимые комплексы dNTP производящие субстрат, определяемый ферментом полимеразы. Равное количество всех четырех dNTP также помогает уменьшить частоту ошибок полимеразы. Некоторые добавки, такие как BSA, детергенты, DMSO, глицерол и пирофосфат также могут повлиять на специфичность фермента или эффективность реакции.

6. Тип термоциклера.

При выборе лабораторного оборудования часто бросается в глаза тот факт, что некоторые термоциклеры менее точные, чем другие в сохранении нужных температур. Это одна из областей, где выбор более дешевого продукта не поможет вам в далекой перспективе, особенно если вы столкнетесь с потребностью в более точных результатах или использованию праймеров, которые требуют узкого диапазона температур отжига. Тонкостенные пробирки разработаны специально для оптимизации работы вашего точного термоциклера.

7. Настройки цикла.

Длина цикла реакции, температур и количество циклов, все это имеет критическое значение в определении как хорошо пройдет диагностика ПЦР. Начальный нагрев должен быть достаточно долгим для полной денатурации образца ДНК и циклы должны быть достаточно длинными для того чтобы предотвратить расплавленный ДНК от воссоединения. Увеличение прироста может быть достигнуто при помощи увеличения времени удлинения через каждые 20 циклов, чтобы компенсировать меньшее количество фермента. Обычно менее чем 40 циклов достаточно для того, чтобы амплифицировать менее чем 10 молекул образца до концентрации, необходимой чтобы увидеть его на окрашенном бромистым этидием агарозным гелем.