Real-time ПЦР

 

История современного ПЦР начинается в 1976 году с выделения Taq-полимеразы из термофильных бактерий Thermus Aquaticus. Его выделение стало революционным шагом, молекулярные биологи теперь получили тот самый термостабильный фермент, который освободил биологов от необходимости каждый раз добавлять свежий фермент ДНК- полимеразы после каждого цикла. А ведь раньше приходилось добавлять фермент до 40 раз подряд, что занимало уйму драгоценного времени и сил.

 

Тем не менее, важность Taq полимеразы для молекулярной биологии не была высокой вплоть до 1988 года, когда Карого Муллис и Cetus Corporation начали изготавливать этот фермент для коммерческого использования. Успех Taq полимеразы был мгновенным, это соединение даже получило звание молекулы года журнала ‘Science” в 1989 году. Но на этом наука не остановилась. В 1991 году началась активная разработка фермента Pfu, выделенной из архебактерии Pyrococcus furiosus, который способен исправлять ошибки на полинуклеотидных цепях. Прогресс молекулярной биологии и химии, в сочетании с выпуском первых приборов Real Time ПЦР 1995-1996 годах смогли значительно упростить метод. Вместо слежения за многократными циклами ПЦР на водяной бане, достаточно было только задать программу, а маленький аппарат и ферменты выполняли всю кропотливую работу.

 

Теперь перейдем непосредственно к самому методу. В молекулярной биологии, ПЦР в реальном - лабораторный метод, основанный на методе полимеразной цепной реакции, используется для одновременной амплификации (копирования) и измерения количества данной молекулы ДНК. Метод ПЦР в реальном времени включает в себя одновременно детекцию и количественное определение (измерение непосредственно количества копий, либо измерение копий относительно внесенной ДНК или дополнительных калибровочных генов) специфической последовательности ДНК в образце.

 

 

Метод использует общие принципы ПЦР. Основное отличие состоит в том, что измеряется количество амплифицированной ДНК в реальном времени после каждого цикла амплификации. Для количественного определения используют два метода - флюоресцентные красители, интеркалирующие в двуцепочечные молекулы ДНК, и модифицированные олигонуклеотиды (ДНК-зонды), которые флюоресцируют после гибридизации с комплементарными участками ДНК.

 

Часто ПЦР в реальном времени комбинируют с ОТ-ПЦР (обратная транскрипция) для измерения малых количеств мРНК, что позволяет исследователю получать количественную информацию о содержании данной мРНК в клетке и, соответственно, позволяет судить об уровне экспрессии данного гена в отдельной клетке или ткани.

 

Процедура очень похожа на процедуру классического ПЦР, то есть присутствуют все стадии реакции - плавление или денатруация двухцепочечных ДНК при температуре 95 ̊C, отжиг праймеров (температура отжига зависит от используемых праймеров) и элонгация при температуре 72 ̊С, если используется Taq-полимераза. Принцип ПЦР в реальном времени заключается в детекции ПЦР-продукта по мере его накопления.

 

Сегодня это возможно сделать благодаря высокоспецифичным флуоресцентным зондам. Существует два основных подхода генерации света у таких зондов — во время элонгации и отжига, но, в обоих случаях флуоресценция усиливается с каждым новым циклом. Таким образом, сила сигнала говорит о первоначальном количестве интересующей молекулы.

 

На начальных этапах флуоресценция слабая, так как продукта еще не очень много, поэтому ее трудно отличить от фона. По мере накопления продукта, сигнал растет сначала экспоненциально, а затем выходит на плато. Выход на плато объясняется нехваткой того или иного компонента реакции — могут закончиться праймеры, нуклеотдилтрифосфаты, метка. Если продукта реакции накопилось слишком много, то лимитирующим фактором может стать фермент, и тогда зависимость количества продукта от цикла станет линейной.

 

Стоит отметить, что в стандартной реакции ПЦР в реальном времени все образцы выйдут на плато и достигнут примерно одного уровня сигнала. Таким образом, конечная точка ничего не скажет о начальном количестве исследуемого образца. С другой стороны, в экспоненциальной фазе можно проследить отличия в скорости роста продукта. Различия в начальном количестве молекул влияют на количество циклов, необходимых для понятия уровня флуоресценции выше уровня шума ПЦР в реальном времени широко используется для решения многих исследовательских задач в лабораториях. Кроме того, этот метод нашел применение в медицине (для диагностики заболеваний) и в сфере биотехнологий (для определения содержания микроорганизмов в продуктах питания и растительных материалах; для детекции ГМО).

 

Также к ПЦР используется для генотипирования вирусов и других патогенов человека и определения их количественного содержания. Количественная ПЦР применяется для быстрого выявления генов или фрагментов ДНК, являющихся маркерами инфекционных заболеваний, генетических отклонений и т. д.

 

Внедрение этого метода в клинические лаборатории значительно улучшило качество диагностики инфекционных заболеваний. Кроме того, кПЦР используется в качестве инструмента для детектирования вновь возникающих заболеваний. Например, новых штаммов гриппа.

 

Использование кПЦР также позволяет проводить количественные измерения и генотипирование (характеристика штаммов) вирусов, например, вируса гепатита В. Степень инфекции, которая оценивается, как число копий вирусного генома на единицу ткани пациента, имеет большое значение во многих случаях. Например, вероятность реактивации вируса простого герпеса типа 1 зависит от количества инфицированных ганглиев. В зависимости от того, интегрировал ли вирус в геном пациента (как, например, в случае вируса папилломы человека) или нет, количественный анализ осуществляется с применением обратной транскрипции или без нее.

 

Количественная ПЦР также широко используется для детекции опухолевых клеток в материале из плотных опухолей (solid tumours) и даже при некоторых формах лейкемии.

 

Выявление циркулирующих опухолевых клеток. Рак молочной железы все еще является наиболее частой причиной смерти среди раковых больных. Причем, часто смерть вызвана не только самой опухолью, но и возникшими метастазами. Сами метастазы возникают в результате того, что особенные клетки, способные к пролиферации, отделяются от опухоли, выходят в кровяное русло и вторично поселяются в какой-то части организма. Эти клетки называются циркулирующими стволовыми клетками (ЦСТ). Присутствие таких клеток в крови пациентов, больных раком молочной железы, как правило, связано с плохим прогнозом исхода терапии и выживаемости в целом, поэтому является очень важным диагностическим параметром.

 

Но из-за очень низкого количества, выявление ЦСТ является довольно трудной задачей. И кПЦР, как высокочувствительный метод, может быть использован для решения этой проблемы. Дело в том, что, как и все раковые клетки, ЦСТ имеют эпителиальной происхождение и, следовательно экспрессируют определенный набор генов, отличающийся от окружающих их клеток крови, имеющих мезенхимальное происхождение. Для применения этого метода необходимо определить набор генов- маркеров ЦСТ и оценить их уровень экспрессии.

 

ПЦР в реальном времени также применяется для микробиологических работ в сфере безопасности продуктов питания, для оценки качества вод (питьевых и сточных) и в сфере здравоохранения. Кроме того, данный метод используется для идентификации кишечной микрофлоры.

 

В ходе проведения исследований, кПЦР в основном используется для проведения количественных измерений транскрипции генов. Данный метод широко применяется для оценки изменений во времени экспрессии определенного гена, например, в ответ на введение лекарственного средства или изменения условий окружающей среды. Он также используется для определения зиготности трансгенных животных, используемых в исследовании. Для решения некоторых задач данный метод специально модифицируется кПЦР также используют для определения количества малых ядрышковых РНК (мяРНК) мяРНК отличаются по свойствам от мРНК тем, что имеют очень малую длину (около 22 нуклеотидов), не имеют консервативной последовательности на концах, при этом мяРНК одной популяции могут отличаться на один или несколько нуклеотидов. Для решения этих проблем используют подходы, основанные на добавлении небольшого участка ДНК (линкера) к кДНК в реакции обратной транскрипции. Затем проводится ПЦР в реальном времени стандартными способами с использованием праймеров, комплементарных линкеру.

 

ПЦР в реальном времени можно использовать для измерения количества белка Для измерения количества белка в клетке используют следующий подход:

 

1. Создают два вида антител к целевому белку с пришитыми последовательностями ДНК таким образом, что при взаимодействии с белком, 3’ конец одной последовательности оказывается недалеко от 5’-конца второй ДНК последовательности.

 

2.Получается, что каждой молекуле белка соответствует известная нам последовательность ДНК, количество которой потом можно анализировать с помощью классического кПЦР-анализа.

 

Обнаружение фитопатогенов. Агропромышленность стремится производить семена и рассаду, не содержащую патогенных микроорганизмов, с целью предотвращения экономических потерь и увеличения срока хранения. Поэтому были разработаны системы, позволяющие обнаружить небольшие количества ДНК фитофторы (Phytophthora ramorum), оомицетов и некоторых других патогенов, которые приводят к гибели дубов и других видов растений, в смеси с ДНК растения-хозяина. Возможность различить ДНК возбудителя и растения-хозяина основана на амплификации последовательностей ITS (internal transcribed spacer), внутренних транскрибируемых участков, расположенных в кодирующей области гена рибосомной РНК, которые характерны для каждого таксона.

 

Детекция генетически модифицированных организмов. кПЦР (с использованием обратной транскрипции) может быть использована для детекции ГМО (генно модифицированных организмов), так как является более чувствительным по сравнению со многими другими методами. При этом специфические праймеры используются для амплификации промоутера, терминатора или даже промежуточных последовательностей, используемых в процессе создания вектора. Так как процесс создания трансгенного растения обычно приводит к вставке более, чем одной копии трансгена, его количество также обычно оценивается с помощью кПЦР. При этом в качестве контроля используют растение, содержащее данный ген в единственном экземпляре.